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细胞功能研究试验之一:细胞划痕试验知多少?
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  • 2023-11-21

一、试验原理

      细胞划痕法是简捷测定细胞迁移运动和修复能力的方法,类似体外伤口愈合模型,在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上,用微量枪头或其它硬物在细胞生长的*区域划线,去除*部分细胞,然后继续培养细胞至试验设定时间,观察周边细胞是否迁移至*划痕区,以此判断细胞的生长迁移能力。试验通常需设定对照组和供试品组,通过不同分组之间的细胞对于划痕区修复能力的不同可以判断供试品迁移与修复能力。


二、适用对象

      包括加了某种处理因素、药物、重组蛋白、外源性基因、生长因子等供试品。


三、试验步骤

1)所有使用的器具均需要灭菌,包括直尺和marker笔在使用前需要放在洁净台内用紫外灯照射30min以上;

2)用marker笔比着直尺在6孔板背后每孔横向和纵向各三等份划线做记号,按照5×105cell/孔接种细胞,具体数量可根据细胞不同而调整,目标以过夜能达到95%以上汇合率为宜;

3)细胞培养24h后用10μL枪头比着直尺对准孔板,轻推横向、纵向划线形成划痕,用PBS漂洗细胞3次,去除划掉的细胞;

4)在对照组和供试品组孔中加入无血清培养基配制的供试品和对照样品,空白对照组只加入无血清培养基;

5)转移至37℃、5%CO2培养箱中,于0h、24h时,以横向和纵向的交点为核心,在显微镜下拍照;

注1:在用PBS缓冲液冲洗时,注意贴壁慢慢加入,以免冲散单层贴壁细胞,影响试验拍照结果。

注2:一般做划痕试验,都是无血清或者低血清(<2%),否则细胞增殖就不能忽略。

注3:不同孔之间较好用同一个枪头。

四、数据统计

      测量划痕区面积,通过固定划痕区移行细胞的总面积除以固定划痕区初始面积,计算每组细胞迁移率。


试验示例

1.试验材料

1 (2)

2. 试验步骤

1)用marker笔比着直尺在6孔板背后每孔横向和纵向各三等份划线做记号,将细胞按照5×105cell/孔接种,加入10%CS的DMEM培养液培养24h,使形成单层细胞;

2)细胞培养结束后用10μL枪头比着直尺对准孔板,轻推横向、纵向划线形成划痕,用PBS漂洗细胞3次,去除划掉的细胞;

3)在对照组和供试品组孔中分别加入2mL终浓度为0.5mg/mL的无血清培养基配制的人重组胶原蛋白和牛I型胶原蛋白,空白对照组只加入2mL无血清培养基;

4)转移至37℃、5%CO2培养箱中,于0h、24h/48h、72h时,以横向和纵向的交点为核心,在40倍显微镜下拍照;

5)每组3个重复孔,共27个数据;

3. 试验结果

1
2
对照组-0h
对照组-24h
3
4
对照组-48h
对照组-72h
5
6
试验组-0h
试验组-24h
7
8
试验组-48h
试验组-72h
3 (2)

注:如果长时间观察时,需考虑到划痕缩小是细胞迁移和细胞繁殖共同作用的结果,而不是单纯的细胞迁移,如果要单纯的考虑细胞迁移,先用丝裂霉素(1 μg/mL)处理一小时,抑制细胞的分裂。另外,使用无血清培养基也可以降低细胞增殖对实验结果的影响,但同时由于细胞内信号传导系统整体性的下调节,细胞迁移的速度也会有所改变。

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