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基因治疗类产品质量控制分析方法
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  • 2022-08-09
基因治疗(gene therapy)是指将外源正常基因导入靶细胞,以纠正或补偿基因缺陷和异常引起的疾病,从而达到治疗目的,也就是通过基因转移技术将外源基因插入患者适当的受体细胞中,使外源基因表达的产物能治疗某种疾病。基因治疗技术从1990年开始第1例临床试验至今,经历了近30年的发展,已成为国内外药物研发的热点。对研发阶段的基因治疗产品开展质量研究,建立相应的质量控制方法和质量标准,是产品安全、有效的重要保证和产业化进程中的重要环节之一。基因治疗产品的质量控制项目包括鉴别、含量、效价、纯度、杂质和其他常规检测项目等。
基因治疗产品的质量控制分析方法
基因治疗是一种新兴治疗方式,其治疗机制、基因治疗载体安全性、临床试验安全性的研究积累尚不完善。国内关于基因治疗的生产标准和规范仍不成熟,监管体系尚不全面,相关法规政策亦根据行业的发展情况持续调整。因此,产品质控方法和质量标准的研究是创新基因治疗产品研发中的一个重要内容,是决定产品能否进入临床研究以及顺利上市的重要环节之一。基因治疗产品通常由各种病毒或非病毒载体携带治疗基因组成,不同种类基因治疗产品的结构特点和质量属性差异较大,质控方法和质量标准具有较大的复杂性。基因治疗产品质量控制的项目包括鉴别、含量、效价、纯度、杂质和其他常规检测项目等,针对每个项目,不同类型的产品具有不同的分析方法。
1、鉴别

基因治疗药物的鉴剔试验常需要从核酸水平和蛋白水平进行。核酸水平常采用限制性酶切图谱分析、聚合酶链式反应(PCR)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和核酸序列测定等方法对载体和目的基因进行鉴定。在PCR和RT-PCR中,应对载体部分、插入基因、缺失片段以及影响表达的重要部分进行鉴定,同时应设置合适的阳性和阴性对照样品。蛋白水平鉴定常采用的方法有十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和印迹,也应设置合理的对照品进行比较。病毒颗粒还可进一步通过衣壳蛋白、标记和表型特征等进行鉴别。
2、含量

在以病毒为载体的基因治疗产品中,滴度是表示产品含量即病毒数量的指标。病毒滴度分为总颗粒数、基因组滴度、感染性滴度、转导滴度等不同的类型。总颗粒数和基因组滴度表示病毒的物理数量,为物理滴度;感染性滴度和转导滴度表示有生物活性病毒的数量,为生物滴度。非病毒载体的基因治疗产品的含量通常是指其中的质粒DNA含量。常用的检测方法有:紫外吸收法、酶联吸附试验(ELISA)、透射电子显微镜(TEM)、高效液相色谱(HPLC)法、血凝试验、定量PCR(qPCR)、DNA斑点杂交、数字PCR、 噬斑(PFU)法和半数组织细胞感染量法等。

3、效价


根据产品具体情况,应建立至少1个反映产品的生理和/或药理作用模式的生物效价指标。效价测定通常包括对表达基因的功能、目的基因表达量/表达效率、溶瘤活性和肿瘤选择性的测定等。应在研究产品的量效关系基础上,尽可能开发定量检测的方法,并建立适当的效价测定参考标准品,将待测样品与之相比较后计算效价。常用的指标有表达基因的功能测定、目的基因表达量 / 表达效率测定以及溶瘤活性和肿瘤选择性测定。


4、纯度和杂质


基因治疗产品的相关杂质是在制造和储存期间形成的具有与所需产物不同活性、功效和安全性的分子变异体,包括空壳等包装缺陷的病毒或颗粒、聚集体、降解产物以及非超螺旋形式的质粒DNA等。残余的宿主细胞DNA的检测常采用DNA杂交、PicoGreen 染色和定量PCR等方法。对于基因治疗产品,如果基因载体和宿主细胞DNA有同源的序列,可能会对DNA杂交法检测宿主细胞DNA造成干扰,建议使用特异性更好的定量PCR法。对于慢病毒、仙台病毒等RNA病毒载体,采用对DNA特异染色的PicoGreen染色法,实验操作更为简便、快速。残留宿主细胞蛋白或来自细胞培养基的蛋白可以通过ELISA、SDS-PAGE分析和/或印迹法进行检测。空壳病毒等可通过电镜、HPLC、分析超速离心、电荷检测质谱等技术进行检测。


5、复制型病毒或野生型病毒


对于复制缺陷型病毒载体,在生产中可能发生经缺失改造的载体与野生型病毒序列之间的同源重组,导致产生复制型病毒。终产品中复制型病毒的存在则可能引起病人的不良反应,构成临床上的隐患和潜在危险。因此,对于这类产品的复制型病毒检测是安全性检测中非常重要的项目。采用的分析方法可以是感染相应细胞并连续培养后,基于细胞病变的方法,或者PCR法、定量PCR法。在一定情况下也可直接采用PCR法或定量PCR法检测,但这时检测的是复制型病毒的核酸片段,不一定为活性病毒,因而可造成假阳性结果。不管采用何种方法,都需要验证其检测下限,并且每次实验应包含加标对照(spike controls)以保证灵敏度达到要求。

另外,常规理化检测项目和常规安全性检测项目(例如:外观、pH、装量、可见异物、不溶性微粒、渗透压、辅料含量、无菌检查、细菌内毒素检查/热原检查和异常毒性检查、支原体检查等项目)也需要符合相应的规定。从而保障这些产品安全、有效和质量可控,保证人民健康水平的提高。

关键词:  基因治疗类产品质量分析  功能性验证报告  生物药物理化表征和质量研究分析  保健食品毒理检测  透明胶生物降解检测  毒害物质检验报告

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