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支原体检测方法大PK
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  • 2022-08-09

实验室和细胞工厂在细胞培养过程中,支原体污染一直是困扰我们的疑难杂症。据统计,常规细胞培养中支原体污染一般能达到30%,甚至更多,严重干扰了实验结果的可信度。因此,定期进行支原体检测和去除,确保细胞培养体系内无支原体存在才能获得准确有效的实验数据。


支原体是什么?

支原体是1898Nocard等发现的一种类似细菌但不具有细胞壁的原核微生物,能在无生命的人工培养基上生长繁殖,直径50-300nm,能通过细菌滤器。支原体在过去曾称之为类胸膜肺炎微生物,1967年正式命名为支原体。

支原体又称霉形体,为目前发现的较小较简单的原核生物,基因数量为480。支原体细胞中唯一可见的细胞器是核糖体。支原体通常依附在细胞膜表面,结构也比较简单,多数呈球形,没有刚性的细胞壁,因此很多抗生素对其不起作用。只有三层结构的细胞膜,故具有较大的可变性。实验室常见的种类有:口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体、发酵支原体、人型支原体、唾液支原体、肺支原体和梨支原体等。

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支原体污染的原因是什么?

支原体污染一直是困扰实验室细胞培养的难题,其来源主要是有以下几个方面:

1. 细胞之间交叉污染;

2. 工作环境或实验器材的污染;

3. 实验者无菌操作不佳;

4. 培养基或其他试剂污染;

5. 制备细胞的原始组织或器官的污染;




支原体污染的危害是什么?

细胞培养中的污染类型很多,其中细菌和真菌造成的污染相对比较容易检测、预防和去除,然而支原体造成的污染很难察觉,即使生长密度高达107~109CFU/mL也很难有污染迹象(浑浊、pH变化等)。支原体污染后会导致细胞生长变慢,状态变差,不会马上使细胞致死,但会影响细胞内的各种参数,如改变细胞膜抗原性,改变细胞新陈代谢,干扰核酸的合成,改变DNA转染效率导致染色体畸变等。

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支原体检测方法有哪些?

检测支原体的方法一般有分离培养法、指示细胞培养法(DNA染色法)、化学发光法(特异酶学检测)、ELISA法、PCR法。

1.  支原体分离培养法

支原体分离培养法是检测支原体的金标方法,其检测精确度较高。此方法非常经典,在世界范围内得到广泛认可,《中国药典》2020版第四部分3301和欧洲药典第六版2.6.7部分均有记载。这种方法是从可疑的细胞培养体系中取样,并接种到培养基灵敏度检查合格的支原体琼脂培养基上,如果样本中含有支原体,它们就会在支原体琼脂基上生长,较终形成明显可见的特征性菌落。

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由于分离培养法基本不会出现假阴性结果,因此也被誉为支原体检测金标准。不过分离培养法也存在两个弊端,一是检测时间太长,支原体要在培养基上长出明显克隆需要4周左右,且操作也较复杂;二是尽管可以检测绝大多数的支原体种类,但也存在个别无法检测的情况,例如支原体M. hyorhinis




2.  指示细胞培养法(DNA染色法)

指示细胞培养法是指将供试品接种于指示细胞(一般选择细胞质区域较大无污染的Vero细胞或经国家专业鉴定机构认可的其它细胞)中培养后,用特异荧光染料(如Hoechst染料)染色,然后在荧光显微镜下观察。如供试品有支原体污染,就可以在指示细胞表面观察到荧光斑点或荧光颗粒,与细胞核呈现的更大更亮椭圆形的荧光形成鲜明对比。

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指示细胞培养法(DNA染色法)也是《中国药典》2020版第四部分3301认可的支原体检测方法,由于供试品要与指示细胞共同培养,因此也需要3~5天的时间。较大的优点就是较为快速,直观,但是它的灵敏度会比较低,在支原体污染不严重时容易得到模棱两可的结果,只有在污染严重时才能得到可靠度较高的结果。此外Hoechst染色试剂对人体有害,要注意防护;且固定液含有冰乙酸,有刺激性气味,需要在通风橱内进行固定操作;荧光染料都存在淬灭的问题,建议染色后尽量当天完成检测。



3.  化学发光法(特异酶学检测)

化学发光法的原理是利用支原体内特有的酶,与提供的底物相互作用,使其中的ADP转化为ATP,荧光素酶可以利用产生的ATP与荧光素酶底物发生反应,能产生可以被仪器检测到的光。如果没有支原体存在,荧光素酶就没有足够的ATP去发生反应产生光,仪器检测到的数值就比较低;如果有支原体存在,就可以使大量的ADP转化为ATP,供荧光素酶发生反应,产生大量的光,仪器检测到的数值就比较高。

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这种方法的优点是检测的灵敏度高,速度快,但只能检测活的支原体。



4.  ELISA

ELISA法也能用于支原体检测,以ELISA法为基础的支原体检测一般使用针对支原体16S rRNA基因的带标记探针或抗体,也有一些商品化的支原体Elisa试剂盒来检测培养物中是否含有支原体。

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ELISA法是一种很考验操作者技术的检测方法,而且很依赖抗体,有一定局限性,无法对没有抗体或目前找不到抗体的支原体进行检测,而且稍不留意就容易出现实验误差。方法相对复杂,用得也比较少。但是特异性高,时间也比较短,3~5小时就可以观察结果。






5.  PCR

PCR法也是目前较常用的方法,它的检测方式主要有凝胶电泳检测和荧光PCR定量检测。其原理都是在支原体16S rRNA基因的保守区设计引物,通过检测支原体DNA来检测细胞中有无支原体的污染。

在凝胶电泳过程中,支原体DNA会显示为特异性条带,以此指示支原体的存在。

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在用荧光PCR定量扩增时,观察图谱及Ct值可判断是否有支原体存在。

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PCR法的优点是检测灵敏度高,特异性好,检测速度快,可在几个小时内识别细胞培养物中是否有支原体污染。但存在测试过程中污染物易从阳性对照(或其他以前对支原体测试呈阳性的样品)传播到未受影响的样品的风险,从而导致假阳性结果,此外也不能判断灭活处理后的样品是否还有活的支原体。



支原体非常顽强,通常用于细胞培养的绝大多数抗生素都对其无效。无懈可击的细胞培养技术始终是预防支原体感染的较佳方式,另外及时找出受到支原体感染的培养物也很重要,这样才能在感染扩散前快速采取有效措施。

祝实验室各位小伙伴都能早日培养出自己心仪的细胞!


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