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免疫沉淀试验的细节
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  • 2021-04-06
免疫沉淀的实验过程比较简单,一般分为3个阶段;①抗原溶液的制备;②裂解物非特异性本底的预处理;③免疫复合物的形成与纯化。 免疫沉淀的第一步是制备抗原溶液。任何抗原溶液均可作为免疫沉淀的材料来源,但免疫沉淀一般采用细胞或组织制备的裂解物。裂解物的制备可采用多种方法,其中首选用温和的去污剂如非离子去污剂来裂解细胞。该方法能溶解细胞膜,破坏蛋白质之间许多微弱的相互作用,释放出大多数细胞内抗原。更重要的是方法十分温和,不破坏大多数抗原的结构和酶的活力。如果对抗原结构的完整或活力要求不严,或者抗原结合较为紧密,可以采用比较剧烈的条件来制备裂解物,如在强变性剂的溶液中进行煮沸,然后在免疫沉淀前经过稀释去除变性剂。一旦细胞裂解液制备好,即可进行预处理。
免疫沉淀一般用于分析抗原的生化特性,因此要求抗原的纯度尽可能高。抗原和抗体的相互作用与其各自的内在性质有关,故提高该技术信—噪比最容易的方法是降低本底。
经过预处理后,在裂解物中加入特异性抗体,由于抗体对其相应抗原的高度亲和力,因此容易快速形成免疫复合物。然后,将免疫复合物经蛋白A或蛋白G结合的琼脂糖或聚丙烯酰胺微珠等固相基质进行纯化。蛋白A和蛋白G对抗体的Fc段有较高的亲和力。蛋白A/G与抗体结合后,通过洗涤微珠即可除去未结合的蛋白,剩下与基质结合的即是纯化的抗原抗体复合物。
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